Spektrofotometry se staly rutinními nástroji v moderních laboratořích molekulární biologie. Často se používá pro nukleové kyseliny, kvantifikaci proteinů a kvantifikaci bakteriálních růstových koncentrací.
Jednoduchý princip spektrofotometru
Spektrofotometr používá světelný zdroj, který může generovat více vlnových délek, a prochází řadou spektroskopických zařízení pro generování světelného zdroje specifické vlnové délky. Poté, co světelný zdroj projde testovaným vzorkem, absorbuje se část světelného zdroje a vypočte se absorbance vzorku, čímž se převede na koncentraci vzorku. . Absorbance vzorku je úměrná koncentraci vzorku.
Kvantifikace nukleových kyselin
Kvantifikace nukleových kyselin je nejčastěji používanou funkcí spektrofotometru. Oligonukleotidy, jednořetězcová, dvouřetězcová DNA a RNA mohou být kvantifikovány v pufru. Absorpční pík nejvyššího absorpčního píku nukleové kyseliny je 260 nm. Molekulární složení každé nukleové kyseliny je odlišné, takže konverzní faktory jsou různé. Chcete-li kvantifikovat různé typy nukleových kyselin, vyberte předem odpovídající koeficienty. Například absorbance 1 OD odpovídá 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA a 30 μg / ml Olig. Absorbance po zkoušce se převede pomocí výše uvedených koeficientů, aby se získala odpovídající koncentrace vzorku. Před testováním vyberte správný postup, zadejte objem zásobního roztoku a ředidla a poté otestujte slepý vzorek a roztok vzorku. Experiment však nebyl vždy plynulý. Nestabilní hodnoty mohou být pro experimentátora největší bolestí hlavy. Přístroje s vyšší citlivostí vykazují větší drift absorbance.
Princip konstrukce a pracovní princip spektrofotometru ve skutečnosti umožňují, aby se absorbance měnila v určitém rozmezí, to znamená, že přístroj má určitou přesnost a přesnost. Například přesnost Eppendorfova biofotometru je ≤ 1,0% (1A). Výsledky takových vícenásobných testů se pohybují mezi asi 1,0% střední hodnoty a jsou normální. Kromě toho je také nutné vzít v úvahu fyzikálně-chemické vlastnosti samotné nukleové kyseliny a pH pufru, ve kterém je nukleová kyselina rozpuštěna, koncentrace iontů atd .: Pokud je koncentrace iontů během testu příliš vysoká, hodnoty se mění, proto se doporučuje použít určitou hodnotu pH a nízkou koncentraci iontů. Pufry, jako je TE, velmi stabilizují hodnoty. Koncentrace ředění vzorku je také faktorem, který nelze ignorovat: v důsledku nevyhnutelné přítomnosti některých jemných částic, zejména vzorků nukleových kyselin, ve vzorku. Přítomnost těchto malých částic narušuje výsledky testu. Aby se minimalizoval účinek částic na výsledky testu, je třeba, aby absorbance nukleové kyseliny byla alespoň větší než 0,1 A a absorbance je s výhodou mezi 0,1 a 1,5 A. V tomto rozmezí je interference interference částice jsou relativně malé a výsledek je stabilní.
To znamená, že koncentrace vzorku by neměla být příliš nízká nebo příliš vysoká (mimo zkušební rozsah fotometru). Konečně by provozní faktory, jako je míchání, měly být dostatečné, jinak je hodnota absorbance příliš nízká, dokonce záporná; směs nemůže existovat bubliny, prázdná kapalina nemá žádné suspendované látky, jinak se hodnota drasticky unáší; stejná kyveta musí být použita pro testování slepého pokusu a vzorku. Jinak je rozdíl v koncentraci příliš velký; převodní faktor a jednotka koncentrace vzorku jsou vybírány konzistentně; nelze použít kyvetu s opotřebením okna; objem vzorku musí dosáhnout minimálního objemu vyžadovaného kyvetou.
Kromě koncentrace nukleových kyselin spektrofotometr také ukazuje několik velmi důležitých poměrů indikujících čistotu vzorku, jako je poměr A 260 / A 280, který se používá k hodnocení čistoty vzorku, protože absorpční pík proteinu je 280 nm. Čistý vzorek s poměrem vyšším než 1,8 (DNA) nebo 2,0 (RNA). Pokud je poměr nižší než 1,8 nebo 2,0, znamená to přítomnost bílkovin nebo fenolických látek. Symbol 230 ukazuje, že ve vzorku jsou přítomny některé kontaminanty, jako jsou uhlohydráty, peptidy, fenoly atd., A poměr čistší nukleové kyseliny A 260 / A 230 je větší než 2,0. A 320 detekuje zákal roztoku a další interferenční faktory. Pro čisté vzorky je A 320 obecně 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Připojit: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Čína
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com