Úvod do principu a aplikace obecných komponent spektrofotometru

Spektrofotometr je široce používán v biologickém, chemickém, klinickém a environmentálním výzkumu.
Spektrofotometrie měří, kolik světla může chemická látka absorbovat průchodem paprsku světla skrz vzorek ve spektrofotometru.
Měřením detekované intenzity světla lze tuto metodu použít ke stanovení koncentrace rozpuštěné látky ve vzorku.
Koncept spektrofotometrie
Paprsek poslaný do vzorku sestává z fotonového paprsku.
Když se fotony setkají s molekulami ve vzorku, molekuly mohou některé z nich absorbovat, snížit počet fotonů v paprsku a snížit intenzitu detekčního signálu.
Propustnost je součástí světla procházejícího vzorkem. Je definována jako intenzita světla procházející vzorkem při dopadající intenzitě světla.
Absorbance je opačná k propustnosti, což odpovídá množství změřené spektrofotometrem.
Podle absorbance může být koncentrace vzorku roztoku stanovena zákonem Lambertova zákona, který ukazuje, že existuje lineární vztah mezi absorbancí a koncentrací vzorku. Podle Lambertova zákona o pivu je absorbance součinitelem absorpčního koeficientu, což je míra množství světla absorbovaného solutem při dané vlnové délce a vzdálenosti, kterou světlo prochází. Vzorek nebo cestovní vzdálenost a koncentrace rozpuštěné látky. Obecně je cílem měření absorbance změřit koncentraci vzorku.
Složky spektrofotometru
Každý spektrofotometr se skládá ze světelného zdroje, kolimátoru (čočky nebo zaostřovacího zařízení pro přenos silných a přímých paprsků), monochromátoru pro oddělení paprsků různých vlnových délek a voliče délky pro výběr vlny nebo drážky požadované vlnové délky. Vlnová délka světla použitého ve spektrofotometru prezentovaném v tomto videu je v rozsahu ultrafialového a viditelného světla. Spektrofotometr rovněž zahrnuje držák vzorku, fotodetektor a obrazovku zobrazující výsledky detektoru.
Nejnovější spektrofotometr je přímo spojen s počítačem, kde lze kontrolovat experimentální parametry a zobrazovat výsledky.
Pracovní princip spektrofotometru
Při provádění spektrofotometrie je důležité v závislosti na typu použitého biologického nebo chemického roztoku přijmout příslušná preventivní opatření, například nosit rukavice.
Před měřením UV-Vis spektra vzorku zapněte zařízení a nechte lampu a elektroniku zahřát.
Připraví se slepý vzorek stejného roztoku se stejným pH a podobnou iontovou silou, avšak bez analyzovaných složek; protože kyveta a rozpouštědlo mohou rozptylovat světlo, je nutné analyzovat vzorek.
Tradiční držák vzorku spektrofotometru je navržen tak, aby držel plastové a křemenné misky. Pipetujte původní roztok do misky.
Po otření otisků prstů a rozstříknutí na vnější straně mísy vložte kyvetu správně do držáku vzorku a zavřete dvířka víka.
Nezapomeňte zavřít dveře, protože UV záření z otevřeného spektrofotometru může poškodit vaše oči a pokožku.
Naprogramujte požadovanou vlnovou délku nebo rozsah vlnových délek, které budou přeneseny do vzorku. To závisí na nejlepší vlnové délce, kterou může analyzovaná složka absorbovat. Stroj se poté vynuluje změřením slepého vzorku, který odečte spodní absorbanci v důsledku vzorkovacího pufru.
V závislosti na typu spektrofotometrického experimentu, který provádíte, může být nutné před měřením vzorku vytvořit standardní křivku, z níž lze stanovit koncentraci analyzované sloučeniny ve vzorku.
Nechte vzorek dosáhnout správné teploty a jemně promíchejte, aby se zabránilo zavádění bublin. Vzorek pak může být přidán přímo do mísy uvnitř stroje a lze provést odečet.
Po měření absorbance vzorku je experiment správně vypočten; například ke stanovení úrovně koncentrace nebo enzymatické aktivity.
Aplikace spektrofotometru
Jedním z běžných použití spektrofotometru je měření hustoty buněk. Měření buněčné hustoty může být použito k vytvoření logaritmické růstové křivky bakterií, z nichž lze stanovit optimální čas pro integraci rekombinantního proteinu.
Spektrofotometr lze také použít k měření rychlosti chemické reakce. V tomto provedení se absorbance používá ke sledování enzymatické reakce, která mizí s časem prostřednictvím mezilehlé reakce 452 nm. Rychlost tohoto enzymatického kroku lze vypočítat porovnáním dat s příslušnou rovnicí.
Zavedení mikro spektrofotometru eliminuje potřebu držáku vzorku. Tyto spektrofotometry používají k udržování vzorku povrchové napětí.
Mikrospektrofotometr je nejlepší volbou pro měření hmotnosti a koncentrace malých a drahých vzorků, jako jsou biomolekuly, včetně proteinů a nukleových kyselin.
Absorbance proteinů při 280 nm závisí na obsahu aromatických postranních řetězců nalezených v tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu, jakož i na disulfidové vazbě mezi dvěma cysteiny.
Koncentraci proteinu lze stanovit jeho absorbancí při 280 nm a jeho absorpčním koeficientem, který je založen na složení aminokyselin.
DNA a RNA mají maximální absorbanci při 260 nm, z čehož lze stanovit jejich koncentrace. Čistotu nukleových kyselin lze také vyhodnotit z poměru absorbance ke specifickým vlnovým délkám.