Kvantifikace spektrofotometrických kolorimetrických proteinů
Proteiny jsou obvykle směs proteinů. Kolorimetrické testy jsou založeny na složkách bílkovin: Aminokyseliny (např. Tyrosin, serin) reagují s další chromogenní skupinou nebo barvivem za vzniku barevného materiálu. Koncentrace barevného materiálu přímo souvisí s počtem aminokyselin, které protein reaguje, a tím odráží koncentraci bílkovin.
Kolorimetrická metoda
Existuje několik metod, jako jsou BCA, Bradford a Lowry.
Metoda Lowry: Na základě nejčasnější biuretové reakce a zlepšení. Protein reaguje s Cu2 za vzniku modré reakce. Nicméně metoda Lowry je citlivější než Biuret. Nevýhodou je potřeba postupně přidávat několik různých činidel; reakce trvá dlouhou dobu; je náchylný k neproteinovým látkám; proteiny obsahující EDTA, Triton x-100 a síran amonný nejsou vhodné pro tento způsob.
Stanovení kyseliny bicincholininové: Jedná se o novější, citlivější proteinový test. Analyzovaný protein reaguje s Cu2 v alkalickém roztoku za vzniku Cu, který tvoří chelát s BCA za vzniku purpurové sloučeniny s absorpčním pikem při 562 nm. Lineární vztah mezi koncentrací této sloučeniny a proteinu je silný a sloučenina vytvořená po reakci je velmi stabilní. Relativně k metodě Lowry je operace jednoduchá a citlivost je vysoká. Nicméně, podobně jako metoda Lowry, je citlivá na rušení proteinů a detergentů.
Bradfordova metoda: Princip této metody spočívá v tom, že bílkovina reaguje s Coomassie Brilliant Blue za vzniku barevné sloučeniny, která absorbuje při 595 nm. Jeho největším rysem je citlivost, která je dvakrát vyšší než u Lowryho a BCA. Je to jednodušší a rychlejší. Vyžaduje pouze jeden druh reakčního činidla. Sloučenina může být stabilní po dobu 1 hodiny, aby se usnadnil výsledek; Interference s Lowrym, BCA reaguje s redukčními činidly (např. DTT, merkaptoethanol) kompatibilní. Je však stále citlivý na detergenty. Hlavní nevýhodou je, že různé standardy mohou vést k velkým rozdílům ve výsledcích stejného vzorku a žádné srovnatelné výsledky.
Někteří výzkumní pracovníci, kteří jsou poprvé vystaveni kolorimetrickým měřením, mohou být zaměňováni výsledky různých kolorimetrických testů. Jaké metody považujete za zmatené? Vzhledem k tomu, že skupiny reagovaly různými způsoby a chromogenní skupiny nejsou stejné, používají se současně několik metod, aby koncentrace vzorku stejného vzorku nebyly konzistentní. Keller a kol. testovali protein v lidském mléce a zjistili, že koncentrace naměřené Lowrym a BCA jsou výrazně vyšší než koncentrace Bradfordu. Rozdíl byl významný. I když je určen stejný vzorek, standardní vzorek vybraný stejnou kolorimetrickou metodou je nekonzistentní a koncentrace po testu je také nekonzistentní. Například použijte Lowry pro testování bílkoviny v buněčném homogenátu za použití standardního BSA s koncentrací 1,34 mg / ml a globulinu jako standardního roztoku s koncentrací 2,64 mg / ml. Před výběrem kolorimetrické metody je proto vhodné odkazovat na chemické složení testovaného vzorku a najít standardně chemicky podobný standardní protein. Kromě toho kolorimetrická metoda pro kvantifikaci proteinů často způsobuje problémy tím, že hodnota absorbance vzorku je příliš nízká, což vede k velkému rozdílu mezi naměřenou koncentrací vzorku a skutečnou koncentrací. Klíčovou otázkou je, že barva důležité části spektrofotometru 1011, kyveta má určitý poločas, takže každá kolorimetrická metoda uvádí průběh zkušebního času. Všechny vzorky (včetně standardních vzorků) musí být v této době testovány. Je-li čas příliš dlouhý, získá se získaná hodnota absorbance menší a hodnota převedené koncentrace se snižuje. Kromě toho jsou reakční teplota, hodnota pH roztoku atd. Důležitými faktory, které ovlivňují experiment. Navíc je velmi důležité používat plastovou kolorimetrii. Nepoužívejte kyvety vyrobené z křemene nebo skla, protože barva po reakci způsobí zbarvení křemene nebo skla, což vede k nepřesné absorbci vzorku.
Společnost se specializuje na prodej spektrofotometrů , vítáme zákazníky, kteří potřebují poradit a nakupovat, poskytneme vám upřímné služby a kvalitní výrobky, stejně jako nižší ceny.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com